閆濤1,2 宋振綸2 Masoumeh Moradi2 楊麗景2 肖濤1,2 侯利鋒1

    1. 太原理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院太原030024;2. 中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所中國科學(xué)院海洋新材料與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寧波315201

    1 前言

    金屬材料浸泡在海水中，微生物會迅速附著，并在材料表面形成一層生物膜。這層生物膜將改變材料的表面狀態(tài)及周圍微環(huán)境，如溶氧量、離子濃度和pH值等，從而影響材料的腐蝕行為。通常微生物附著會加速金屬構(gòu)件的腐蝕，如厭氧的硫酸鹽還原菌（SRB），在厭氧環(huán)境下，SRB將會大量繁殖并產(chǎn)生黏性物質(zhì)加速金屬的腐蝕。人們對此投入了大量的研究，并提出了SRB 加速腐蝕的多種機(jī)理[1,2]。近期，研究人員發(fā)現(xiàn)[3]，部分微生物可以抑制碳鋼、鋁合金和銅合金等的腐蝕。微生物抑制金屬腐蝕的機(jī)理主要有：微生物的呼吸作用會降低金屬表面的氧濃度，從而減緩金屬的腐蝕[4]；微生物分泌產(chǎn)物胞外聚合物與金屬離子耦合，在金屬表面形成致密的生物膜，從而抑制金屬的腐蝕[5]。此外，部分導(dǎo)電性固體材料表面形成的生物膜具有電活性，它們可以將培養(yǎng)基中的電子傳遞至材料表面，抑制腐蝕的進(jìn)行[6]。同一種微生物往往可以抑制多種金屬材料的腐蝕，相對于化學(xué)緩蝕劑，微生物防腐是一種高效及綠色環(huán)保的材料保護(hù)方法，因此一些學(xué)者提出使用再生生物膜來控制腐蝕的觀點(diǎn)[7]，并已在實(shí)驗(yàn)室將Al2024、碳鋼和彈殼黃銅作為基體進(jìn)行了研究。但是需要指出的是，生物膜的形成是一個復(fù)雜的生物和化學(xué)過程，其緩蝕作用往往是通過多種形式共同作用來實(shí)現(xiàn)的，因此在將生物膜作為抑制腐蝕性物質(zhì)前，必須了解微生物抑制金屬腐蝕的機(jī)理。

    本課題組[8]在前期研究階段分離出一種新的具有高度緩蝕作用的細(xì)菌，經(jīng)鑒定屬于新喀里多尼亞弧菌（Vibrio neocaledonicus），它可以在碳鋼表面形成一層致密的生物膜，從而使其腐蝕速率降低60倍。為了進(jìn)一步研究該微生物的緩蝕機(jī)理，本文選取Cu為研究對象，通過電化學(xué)方法和表面分析技術(shù)研究了新喀里多尼亞弧菌對Cu 在人工海水中腐蝕行為的影響，并討論了該細(xì)菌對Cu的腐蝕抑制作用機(jī)理。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)中所用材料分為純Cu 和鍍銅硅片兩種。其中，鍍銅硅片采用物理氣相沉積法（PVD） 制備，Cu 薄膜厚度為6 μm，用來觀察細(xì)菌的吸附及生物膜的形成過程。純Cu 樣品經(jīng)水砂紙逐級打磨至2000#后拋光，丙酮脫脂后用蒸餾水清洗，然后在無水乙醇中超聲清洗5 min，用N2吹干備用。實(shí)驗(yàn)前將樣品浸泡在無水乙醇中，紫外照射滅菌30 min。

    2.2 菌種來源及培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)所用菌種來源于東海海域，是一種好氧型細(xì)菌。采用Axygen 基因組DNA提取試劑盒提取純化培養(yǎng)獲得的細(xì)菌DNA。利用引物27F和1492R擴(kuò)增16sRNA 基因序列全長，PCR 產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化測得序列全長，然后通過細(xì)菌模式種網(wǎng)站對比，發(fā)現(xiàn)該菌種與Vibrio neocaledonicus （NC470（T）） 相似度最高，達(dá)到99.72%，因此，判斷該細(xì)菌為Vibrio neocaledonicussp.。

    使用修正過的2216e 培養(yǎng)基對細(xì)菌進(jìn)行好氧富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為人工海水1 L，魚粉蛋白胨3 g，瓊脂20 g。人工海水的成分（g/L） 為：NaCl 23.476，Na2SO4 3.917，KCl 0.667，KBr 0.096，MgCl2·6H2O10.61，CaCl2·6H2O 1.469，H3BO3 0.026 和NaHCO30.192。將該菌種均勻的涂抹在滅菌后的新鮮培養(yǎng)基中，4 ℃保存于冰箱中備用。使用時先將細(xì)菌接種在新鮮的培養(yǎng)基中，放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，之后按一定比例接種到實(shí)驗(yàn)溶液中，即為有菌介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)溶液中不含瓊脂，其余成分與培養(yǎng)基一致。實(shí)驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)溶液及實(shí)驗(yàn)器材用壓力蒸汽滅菌器在120 ℃下高溫滅菌15 min，冷卻后紫外照射滅菌30 min。

    本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測定細(xì)菌的生長曲線，利用紫外分光光度計(jì)（Lambda 950） 測定有菌介質(zhì)中的光密度（O.D.） 值來推知菌液的濃度，將所測得的O.D.值與對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，本實(shí)驗(yàn)選擇的波長為600 nm。

    2.3 失重實(shí)驗(yàn)

    試樣分別浸泡在無菌介質(zhì)和有菌介質(zhì)中密封好，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，5 和10 d。浸泡前稱重，浸泡結(jié)束后先用去離子水沖洗，然后放在10% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)） H2SO4溶液中浸泡3 min 以除掉Cu表面的腐蝕產(chǎn)物，酒精沖洗，吹干后稱重。

    2.4 電化學(xué)測試

    電化學(xué)阻抗譜和極化曲線測試在電化學(xué)工作站（PGSTAT302，Autolab） 上進(jìn)行，采用三電極體系，輔助電極為Pt 電極，參比電極為飽和KCl 甘汞電極（SCE），工作電極為Cu，電極暴露面積為3.125 cm2，非工作面用環(huán)氧樹脂封裝。測試前，將Pt 電極、Cu 電極及鹽橋浸泡在無水酒精中，紫外照射滅菌30 min。電化學(xué)阻抗譜（EIS） 測試擾動電位幅值為±10 mV，測試頻率范圍為10-2~105 Hz，極化測試掃描范圍為相對開路電位±500 mV，掃描速率為2 mV/s。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)時，在300 mL細(xì)口瓶中加入150 mL滅菌的2216e 液體培養(yǎng)液，然后接種過夜培養(yǎng)的新喀里多尼亞弧菌作為有菌介質(zhì)，無菌介質(zhì)為滅菌的2216e 培養(yǎng)液，通過定期更換滅菌培養(yǎng)液來保持無菌環(huán)境。將Cu試樣浸泡在實(shí)驗(yàn)溶液中密封好，放置在30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期進(jìn)行電化學(xué)測試。

    2.5 細(xì)菌的吸附及生物膜的組成分析

    利用激光共聚焦顯微鏡（LeiCa TCS SP5） 觀察Cu 表面的細(xì)菌吸附情況。將浸泡在有菌介質(zhì)中的Cu 片取出后，用3 mL/L 熒光染色劑SYT09 對Cu 表面進(jìn)行染色處理（SYT09 可以穿透細(xì)胞壁與DNA結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光），避光靜置20 min 后，用超凈水將Cu表面的染色劑沖洗掉，放置在空氣中干燥后用于激光共聚焦顯微鏡（CLSM） 觀察。

    將浸泡在無菌介質(zhì)中的試樣取出后，依次用濃度為50%，70%，90%和100%的乙醇脫水15min，然后用N2 吹干，表面噴金，利用掃描電子顯微鏡（SEM，Quanta FEG 250） 觀察樣品表面形貌。樣品表面元素含量可用自帶的能譜儀（EDS） 進(jìn)行分析。有菌介質(zhì)中浸泡的試樣，取出后先放在戊二醛中硬化2 h，然后經(jīng)脫水、干燥、噴金后用于SEM觀察及EDS分析。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 細(xì)菌生長曲線

    圖1 為細(xì)菌在培養(yǎng)液中的生長曲線。縱坐標(biāo)為O.D.值，反映了溶液中細(xì)菌的數(shù)量，O.D.值越大說明細(xì)菌濃度越高。可以看出，細(xì)菌數(shù)量在前24 h 迅速增長，由于開始培養(yǎng)液中的營養(yǎng)豐富，細(xì)菌生長繁殖不受底物的限制，此時細(xì)菌處于對數(shù)生長期。24 h浸泡后，細(xì)菌數(shù)量維持在一個相對恒定的階段，處于穩(wěn)定生長期，直到96 h，依然沒有進(jìn)入衰落期。為了使培養(yǎng)液中細(xì)菌一直處于生命活躍狀態(tài)且數(shù)量大致恒定，選擇每72 h 更換1/3的培養(yǎng)液。

    3.2 失重實(shí)驗(yàn)

    Cu的腐蝕速率按下式計(jì)算：

    V = （W -W0）/ST（1）

    其中，V 為腐蝕速率（g/（m2·h））；W0為試樣浸泡前的質(zhì)量（g）；W為浸泡后的質(zhì)量（g）；S 為試樣面積（m2）；T 為浸泡時間（h）。此外，可以用生物膜保護(hù)效率η來表征細(xì)菌的緩蝕作用：

    η = Vbacteria/Vsterile（2）

    式中，Vbacteria為試樣浸泡在有菌介質(zhì)中的腐蝕速率，Vsterile為試樣浸泡在無菌介質(zhì)中的腐蝕速率。η＜1，表明微生物會抑制材料的腐蝕；η＞1，表明此時微生物會促進(jìn)腐蝕[9]。Cu浸泡在有菌介質(zhì)和無菌介質(zhì)中的失重?cái)?shù)據(jù)見表1。

    由表1 可知，在無菌環(huán)境中，Cu的腐蝕速率隨浸泡時間延長而增大，原因是在溶液中有害離子的侵蝕下，Cu 表面初始形成的鈍化膜逐漸被破壞，使Cu的腐蝕速率變大。在有菌介質(zhì)中，浸泡2，5 和10 d后，η＜1，說明微生物對基體具有保護(hù)作用。同時還發(fā)現(xiàn)，在有菌介質(zhì)中，Cu在浸泡前后質(zhì)量變化不大，說明在細(xì)菌的保護(hù)作用下，Cu表面幾乎沒有腐蝕。

    3.3 電化學(xué)測試

    3.3.1 開路電位  Cu 電極在無菌介質(zhì)和有菌介質(zhì)中開路電位隨時間的變化曲線如圖2 所示。可見，在無菌介質(zhì)中，Cu 的開路電位變化較為平穩(wěn)。在有菌介質(zhì)中，經(jīng)過短暫的平穩(wěn)期，Cu 的開路電位即發(fā)生了較大程度的負(fù)移，浸泡1 d 后負(fù)移390 mV；在浸泡后期，穩(wěn)定在-0.7 V附近。Cu 電極開路電位的負(fù)移是因?yàn)槲⑸锏奈胶托玛惔x活動改變了Cu表面的電化學(xué)性質(zhì)。吸附在Cu表面的細(xì)菌通過呼吸作用消耗金屬表面的溶解氧，從而導(dǎo)致Cu的開路電路負(fù)移[10]，1 d 后，Cu表面吸附的細(xì)菌數(shù)量飽和，使Cu的開路電位穩(wěn)定在約-0.7 V。

    3.3.2 電化學(xué)阻抗譜  圖3 和4 分別為Cu 在有/無菌介質(zhì)中的EIS 測試結(jié)果。從圖3a 中可看出，在有菌介質(zhì)中，Cu從浸泡開始到第5 d，其容抗弧直徑急劇增大；浸泡至第10 d，Cu 的容抗弧直徑有所降低，但仍遠(yuǎn)大于浸泡初始（0 d） 的容抗弧直徑。從Bode 圖中可以看出，Cu 從浸泡開始，其低頻區(qū)的阻抗模值|Z |及相位角急劇增大，到第5 d，達(dá)到最大值，之后略有降低。在無菌介質(zhì)中，Cu 的容抗弧直徑、低頻區(qū)的阻抗模值|Z |及其相位角在浸泡初期均緩慢增大，之后有所降低。

    根據(jù)Cu電極的EIS 特征，選擇圖5a 所示等效電路對Cu 電極在浸泡前及浸泡在無菌介質(zhì)中的EIS進(jìn)行擬合，選擇圖5b 對Cu浸泡在有菌介質(zhì)中的EIS進(jìn)行擬合。其中，Rs表示溶液電阻，Qdl為電極表面雙電層電容，Rct表示電極表面電荷傳遞電阻，Rf為電極表面的膜電阻，Qf為電極表面膜電容。各參數(shù)擬合結(jié)果列于表2 中，其中，Y01為膜電容，Y02為雙電層電容。

    圖5 Cu在浸泡前和浸泡在無菌介質(zhì)中及浸泡在有菌溶液中的等效電路圖

Fig.5 Equivalent circuit models of copper immersed in the solutions without （a） and with （b） bacteria

    從表2 可以看出來，Cu試樣浸泡在無菌介質(zhì)中，其Rct 隨浸泡時間的延長而緩慢增大，最后有所降低。這說明在浸泡初期，Cu表面初始形成的鈍化膜具有一定的保護(hù)作用，減緩了Cu 的腐蝕；在浸泡后期，由于有害離子的侵蝕，鈍化膜逐漸被破壞，其保護(hù)作用消失，Cu 的腐蝕速率變大。在有菌介質(zhì)中，Cu電極從浸泡開始到第5 d，其Rct由初始的0.86 kΩ·cm2增大到第5 d的276.2 kΩ·cm2，約為初始值的321倍；到第10 d，Rct降低為117 kΩ·cm2，但依然遠(yuǎn)大于初始值，且遠(yuǎn)大于同期下Cu在無菌介質(zhì)中的表面電荷傳遞電阻，說明該細(xì)菌可以強(qiáng)烈抑制Cu 的腐蝕，并且這種抑制作用經(jīng)歷了一個先增強(qiáng)后減弱的過程。

    3.3.3 動電位極化曲線測試  圖6 是Cu 浸泡在無菌和有菌介質(zhì)中不同時間后的動電位極化曲線。在無菌介質(zhì)中，Cu 的腐蝕電流密度變化不大，在浸泡后期，自腐蝕電位負(fù)移，說明Cu 的耐蝕性變差。Cu 在有菌介質(zhì)中浸泡過程中，浸泡初期，其腐蝕電流密度迅速降低，在第2 d 達(dá)到最小值；隨著浸泡時間的延長，Cu的腐蝕電流密度開始上升，但是，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時Cu 的腐蝕電流密度仍然小于同期下浸泡在無菌介質(zhì)中的，說明新喀里多尼亞弧菌能抑制Cu 的腐蝕。這一結(jié)果與EIS 結(jié)果一致。同時還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的加入會使Cu 的自腐蝕電位降低，說明細(xì)菌的加入抑制了陰極反應(yīng)的進(jìn)行[11]。

    3.4 細(xì)菌的吸附及生物膜的形成

    3.4.1 細(xì)菌的吸附    圖7 為Cu 浸泡在有菌介質(zhì)中1 和10 d 后的激光共聚焦顯微鏡圖片。從圖7a中可以看出，在有菌介質(zhì)中浸泡1 d 后，Cu表面已基本覆滿細(xì)菌，這會使Cu 的開路電位明顯負(fù)移、阻抗值迅速增大，腐蝕電流密度明顯降低。10 d 后，Cu表面吸附的細(xì)菌已經(jīng)聚集并形成菌落。

  圖7 純Cu試樣浸泡在有菌介質(zhì)中1 和10 d 后的CLSM圖

Fig.7 CLSM images of copper immersed in the solution with bacteria for 1 d （a） and 10 d （b）

    3.4.2 表面形貌分析    圖8 所示為Cu 分別在無菌介質(zhì)（圖8a） 和有菌介質(zhì)（圖8b） 中浸泡10 d 后的SEM像。可以看出，在無菌介質(zhì)中，由于溶液中存在高濃度的有害離子，如Cl-和SO42-等，Cu腐蝕非常嚴(yán)重。在有菌介質(zhì)中，Cu表面可見吸附的細(xì)菌及生物膜，并未見明顯的腐蝕產(chǎn)物，Cu 表面狀態(tài)變化不大，這一結(jié)果與失重實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但是需要指出的是，Cu表面生物膜較少，而CLSM結(jié)果顯示，Cu表面幾乎被細(xì)菌所覆蓋，這說明，Cu 表面吸附的細(xì)菌難以形成生物膜。原因可能是細(xì)菌與Cu 的吸附僅為可逆吸附，Cu表面的細(xì)菌處于吸附與脫附的動態(tài)平衡中，并不易形成生物膜。

圖8 純Cu試樣分別浸泡在有菌介質(zhì)和無菌介質(zhì)中10 d后的SEM像

Fig.8 SEM images of copper after immersion in the solutions without （a） and with （b） bacteria for 10 d

    3.4.3 生物膜的形成  圖9 為鍍銅硅片浸泡在有菌介質(zhì)中不同時間后的SEM像。表3 是鍍銅硅片分別在有菌和無菌介質(zhì)中浸泡不同時間后的EDS結(jié)果。從圖9a 中可以看出，鍍銅硅片浸泡在有菌介質(zhì)中后，細(xì)菌會附著到銅鍍層缺陷處，原因是Cu 表面缺陷處容易腐蝕，易產(chǎn)生氫鍵，在van der waals力、靜電作用力及氫鍵作用下，細(xì)菌傾向于吸附在Cu表面缺陷處。隨著浸泡時間的延長，細(xì)菌胞外產(chǎn)物（EPS） 會黏附在Cu 表面[12]并形成一層由EPS、細(xì)菌及腐蝕產(chǎn)物組成的生物膜。從表3 中可知，相對于無菌環(huán)境，在有菌介質(zhì)中浸泡后的Cu表面氧含量降低，說明細(xì)菌會減緩Cu 的腐蝕。同時還發(fā)現(xiàn)，在有菌環(huán)境下，Cu表面出現(xiàn)P，N和S 等元素，說明這3種元素均是生物源元素。在浸泡1 d 后，Cu 表面出現(xiàn)P，而此時Cu 表面吸附有大量的細(xì)菌，表明細(xì)菌中P 含量較高；在浸泡5d 后，Cu表面P 含量降低，說明生物膜中細(xì)菌數(shù)量減少，細(xì)菌從生物膜中脫附出去。從圖9c 可以看出，細(xì)菌的脫附使金屬表面生物膜變得不均勻，金屬表面Cl-含量也增加，這些都會減弱微生物的緩蝕作用。

圖9 鍍銅硅片浸泡在有菌介質(zhì)中不同時間的SEM像

Fig.9 SEM images of the Cu deposited Si wafer after immersion in the solution with bacteria for 1 d （a）， 2 d （b） and 5 d （c）

    3.5 新喀里多尼亞弧菌對Cu的腐蝕抑制機(jī)理

   圖10 細(xì)菌在Cu表面附著及生物膜的形成機(jī)理

Fig.10 Schematic illustrations of bacterial adhesion and biofilm formation on copper

    如圖10 中的模型所示，在浸泡初期，細(xì)菌大量吸附在Cu 的表面，這些細(xì)菌一方面會消耗Cu 表面溶解氧，另一方面作為阻礙層阻礙有害離子如Cl-向金屬表面擴(kuò)散，從而抑制Cu的腐蝕。由于受到細(xì)菌的保護(hù)，Cu表面溶解較為緩慢，幾乎沒有腐蝕，因而缺乏足夠的活性中心，此時細(xì)菌的吸附多為可逆吸附[13]，EPS 因?yàn)槿狈ψ銐虻呐湮浑x子而不會黏附在Cu 的表面。隨著浸泡時間的增加，Cu 表面某些缺陷處被優(yōu)先腐蝕，細(xì)菌及其分泌產(chǎn)物EPS 便會牢固吸附至腐蝕產(chǎn)物的表面，并進(jìn)一步形成生物膜。在浸泡后期，Cu 表面氧含量降低，細(xì)菌會向氧含量較高的溶液中擴(kuò)散，導(dǎo)致Cu 表面細(xì)菌吸附量減少，細(xì)菌的保護(hù)作用較弱。同時，由于Cu表面的生物膜并不均勻致密，容易形成氧濃差電池，這些將會降低細(xì)菌的緩蝕作用。

    4 結(jié)論

    （1） 新喀里多尼亞弧菌可以抑制Cu在人工海水中的腐蝕。在浸泡初期，細(xì)菌大量吸附至Cu 的表面，對基體起保護(hù)作用，從而抑制Cu的腐蝕。

    （2） 隨著浸泡時間的延長，Cu 表面的細(xì)菌逐漸向溶液中擴(kuò)散，細(xì)菌的保護(hù)作用減弱，同時不均勻的生物膜會產(chǎn)生氧濃差電池，這些都會降低新喀里多尼亞弧菌的緩蝕作用。

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