拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜，由1928年印度物理學(xué)家C.V.Raman發(fā)現(xiàn)的。拉曼效應(yīng)來(lái)源于分子振動(dòng)（和點(diǎn)陣振動(dòng)）與轉(zhuǎn)動(dòng)，從拉曼光譜中可以得到分子振動(dòng)能級(jí)（點(diǎn)陣振動(dòng)能級(jí)）與轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，其譜圖中包含的大量信息：拉曼位移的大小、強(qiáng)度及拉曼峰形狀，半高寬等都是是鑒定化學(xué)鍵、官能團(tuán)、結(jié)晶度、應(yīng)變的重要依據(jù)。拉曼光譜以其信息豐富、制樣簡(jiǎn)單、水的干擾小等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)、材料、物理、高分子、生物、醫(yī)藥、地質(zhì)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

隨著科學(xué)發(fā)展的不斷進(jìn)步，普通的拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)不能滿足研究需求，為此科學(xué)家們不斷給拉曼光譜開(kāi)外掛，發(fā)展了電化學(xué)原位拉曼光譜技術(shù)、受激拉曼散射（SRS）和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）等，這些增強(qiáng)的技能讓拉曼光譜在分子水平上現(xiàn)場(chǎng)表征、無(wú)標(biāo)記生物醫(yī)學(xué)成像、結(jié)構(gòu)可視化等方面不斷為科研人員做出神助攻。

本文將主要介紹這三種開(kāi)掛的拉曼光譜技術(shù)：電化學(xué)原位拉曼光譜技術(shù)、受激拉曼散射（SRS）和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS），并從Science和其他優(yōu)秀期刊中選取幾篇具有代表性的工作對(duì)其相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行介紹。

【簡(jiǎn)介】

表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)是指在特殊制備的一些金屬良導(dǎo)體表面或溶膠中，在激發(fā)區(qū)域內(nèi)，由于樣品表面或近表面的電磁場(chǎng)的增強(qiáng)導(dǎo)致吸附分子的拉曼散射信號(hào)比普通拉曼散射信號(hào)大大增強(qiáng)的現(xiàn)象，克服了拉曼光譜靈敏度低的缺點(diǎn)，可以獲得常規(guī)拉曼光譜所不易得到的結(jié)構(gòu)信息。

受激拉曼散射是指高強(qiáng)度的激光和物質(zhì)分子發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使散射過(guò)程具有受激發(fā)射的性質(zhì)，這種散射光是拉曼散射光，所以這一種非線性光學(xué)效應(yīng)稱受激拉曼散射。

電化學(xué)原位拉曼光譜法是利用物質(zhì)分子對(duì)入射光所產(chǎn)生的頻率發(fā)生較大變化的散射現(xiàn)象將單色入射光（包括圓偏振光和線偏振光）激發(fā)受電極電位調(diào)制的電極表面，通過(guò)測(cè)定散射回來(lái)的拉曼光譜信號(hào)（頻率、強(qiáng)度和偏振性能的變化）與電極電位或電流強(qiáng)度等的變化關(guān)系。一般物質(zhì)分子的拉曼光譜很微弱，為了獲得增強(qiáng)的信號(hào)，可采用電極表面粗化的辦法，可以得到強(qiáng)度高104-107倍的表面增強(qiáng)拉曼散射。

一、原位拉曼光譜技術(shù)研究鉑單晶表面電催化ORR機(jī)理[1]

廈門大學(xué)的李劍鋒教授和西班牙Alicante大學(xué)的Juan Miguel Feliu等人，采用原位電化學(xué)殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜（SHINERS）系統(tǒng)地研究了Pt（hkl）單晶表面的ORR反應(yīng)過(guò)程。該研究在Pt（111）單晶表面獲得了ORR中間物種HO2*的光譜信號(hào)，在Pt（110）和Pt（100）單晶表面，獲得了ORR中間物種OH*的光譜信號(hào)。而在堿性條件下，他們?cè)赑t（hkl）三個(gè)基礎(chǔ)單晶表面獲得ORR過(guò)程的中間物種O2-的光譜信號(hào)。基于原位拉曼光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和DFT理論模擬結(jié)果，他們認(rèn)為在酸性條件下，當(dāng)溶液中的O2分子吸附在Pt（hkl）單晶電極上形成吸附態(tài)的O2*后，經(jīng)過(guò)質(zhì)子電子轉(zhuǎn)移步驟形成HO2*物種，HO2*再進(jìn)一步通過(guò)O-O鍵的斷裂在鄰近Pt原子上形成一對(duì)吸附態(tài)的O*和OH*，最后OH*通過(guò)質(zhì)子電子轉(zhuǎn)移形成H2O。

圖1. 酸性條件下，Pt（hkl）單晶表面ORR過(guò)程分析和Pt（111）單晶表面ORR過(guò)程的原位SHINERS研究及HO2*物種的DFT理論模擬

圖2. 堿性條件下，Pt（hkl）單晶表面ORR過(guò)程的原位電化學(xué)SHINERS光譜圖

本研究不僅獲得了Pt（hkl）表面ORR反應(yīng)過(guò)程中間物種的原位光譜信息，提出了合理的ORR機(jī)理，SHINERS技術(shù)為原子級(jí)平滑的單晶表面的催化過(guò)程的研究和其他界面催化反應(yīng)過(guò)程的原位光譜研究提供了一種有效而可靠的原位光譜途徑。

二、表面增強(qiáng)共振拉曼散射用于高精度癌癥成像[2]

因?yàn)榘┌Y能擴(kuò)散滲透到周圍的組織，且大多數(shù)癌癥的擴(kuò)散邊界不能被清晰地劃分，所以可視化癌癥的擴(kuò)散程度一直是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。此外，癌癥可能是多灶性的并且存在微觀衛(wèi)星病變，容易持續(xù)存在、局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，現(xiàn)有的成像技術(shù)不可能將其可視化。但是臨床和手術(shù)需要一種揭示腫瘤真實(shí)擴(kuò)散程度的成像方法，Stefan等人使用新一代表面增強(qiáng)共振拉曼散射（SERRS）納米粒子（稱為SERRS納米星）顯示腫瘤邊緣，做到局部區(qū)域腫瘤擴(kuò)散的精確可視化。SERRS納米星具有星形金核，在近紅外光譜中有拉曼共振，且不引入雜質(zhì)。在基因修飾的小鼠模型中，以及一種人肉瘤異種移植模型中，SERRS納米星能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肉瘤等肉眼可見(jiàn)的惡性病變以及其他顯微疾病，而無(wú)需靶向部分。此外，SERRS納米星的靈敏度（1.5 fM檢測(cè)限）允許對(duì)胰腺和前列腺腫瘤的癌前病變進(jìn)行成像。高靈敏度和廣泛的適用性，結(jié)合其惰性金-二氧化硅組合物，使SERRS納米星成為一種有前景的成像劑并應(yīng)用于更精確的癌癥成像和癌癥切除。

圖3. 小鼠模型中的乳腺癌成像

AB圖是右上胸腺和右下胸腺中形成兩個(gè)相鄰的腫瘤，C圖是沿著白色虛線切除腫瘤后切除床的光學(xué)圖像和拉曼成像。未切除腫瘤時(shí)，抗PEG IHC染色顯示腫瘤中存在SERRS納米星，從拉曼成像中也能清晰直觀的看到殘留的腫瘤部分，與切除后PyMT染色顯示的殘留腫瘤位置形狀等高度吻合。

SERRS納米星是一類新的分子成像劑，能夠描繪原發(fā)腫瘤，尺寸小至100微米的局部腫瘤沉積以及癌前病變。而且文中對(duì)相關(guān)動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在癌癥哪個(gè)階段這都是可行的。所以將拉曼成像有望被用于腫瘤學(xué)的臨床應(yīng)用：改進(jìn)圖像引導(dǎo)腫瘤切除，使用拉曼內(nèi)窺鏡進(jìn)行早期癌癥檢測(cè)，更深層組織的非侵入性成像。

三、表面增強(qiáng)拉曼光譜研究電化學(xué)中膜的氧化機(jī)理[3]

早在1998年，Casado 等就研究了一系列在不同陽(yáng)極電勢(shì)下被電化學(xué)氧化的α-α‘-2-甲基-噻吩低聚體膜的振動(dòng)光譜，結(jié)合電子吸收數(shù)據(jù)，近紅外拉曼光譜表明在氧化的低聚物中存在自由基陽(yáng)離子。利用摻雜誘導(dǎo)帶的鏈長(zhǎng)分布闡明了這些低聚噻吩基中帶電缺陷的大小。

圖4. 不同的氧化電位下DMQq的傅里葉拉曼光譜

四、受激拉曼散射顯微鏡實(shí)現(xiàn)高靈敏度的無(wú)標(biāo)記生物醫(yī)學(xué)成像[4]

無(wú)標(biāo)記化學(xué)對(duì)比在生物醫(yī)學(xué)成像中非常重要。普通的拉曼顯微鏡雖然能提供化學(xué)鍵的特定振動(dòng)特征，但靈敏度低。而基于受激拉曼散射（SRS）的三維多光子振動(dòng)成像技術(shù)通過(guò)施加高頻（兆赫）相敏檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)極高的靈敏度，圖像無(wú)背景且化學(xué)對(duì)比度易于解釋。可在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，例如區(qū)分活細(xì)胞中ω-3脂肪酸和飽和脂質(zhì)的分布，基于內(nèi)在脂質(zhì)對(duì)比的腦和皮膚組織成像，監(jiān)測(cè)通過(guò)表皮的藥物遞送等。

圖5. SRS原理與設(shè)計(jì)，及其與普通拉曼成像的相關(guān)對(duì)比。

圖6. a. DHA, EPA, AA,OA的普通拉曼光譜，b. 脂滴（LD，紅線）和細(xì)胞核內(nèi)區(qū)域（藍(lán)線）的SRL光譜，c. 2920cm-1處細(xì)胞的SRL圖像，d. 3015cm-1處相同細(xì)胞的SRL圖像。

圖7. 小鼠組織SRL成像

小鼠腦胼胝體神經(jīng)元髓鞘、腦組織、耳朵、皮膚等處-CH2 的SRL成像十分清晰，且組織中的自發(fā)熒光不會(huì)干擾SRS，與CARS成像比較，SRL成像沒(méi)有非共振背景，更加直觀利于解析。

五、拉曼掃描電子顯微鏡（RISE）成像[5]

隨著各類研究的深入，科研人員對(duì)表征技術(shù)的要求也越來(lái)越多樣化，不同的表征技術(shù)相互結(jié)合相互補(bǔ)充，做到1+1>2的現(xiàn)象也越來(lái)越多。有的儀器公司已經(jīng)將拉曼成像和掃描電子顯微鏡結(jié)合，推出了拉曼掃描電子顯微鏡。這是一種無(wú)標(biāo)記的非破壞性技術(shù)，可以用于識(shí)別樣品的分子組成并成像。SEM使樣品的表面結(jié)構(gòu)可視化，其相關(guān)的能量色散X射線光譜學(xué)能識(shí)別元素成分，但難以表征物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而拉曼可以對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，將兩種技術(shù)集成到一起能夠大大加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。拉曼掃描電子顯微鏡是將拉曼顯微鏡所需的物鏡和樣品臺(tái)放置在SEM的真空室內(nèi)，用極其精確的掃描軟件驅(qū)動(dòng)機(jī)制在拉曼和SEM測(cè)量位置之間轉(zhuǎn)移樣品。可用于納米技術(shù)，生命科學(xué)，地球科學(xué)，制藥和材料研究等領(lǐng)域。

圖8. 拉曼掃描電子顯微鏡

常見(jiàn)的還有拉曼與AFM，氣相、液相色譜聯(lián)用，有興趣的同學(xué)可以深入了解一下。

【結(jié)語(yǔ)】

拉曼光譜應(yīng)用前景可期

表面增強(qiáng)拉曼和共焦顯微拉曼光譜等新拉曼技術(shù)，解決了拉曼光譜在早期應(yīng)用中存在的很多問(wèn)題，如熒光干擾、固有靈敏度低等，而且近年來(lái)先進(jìn)激光器的發(fā)展和其他光譜技術(shù)的不斷革新，與氣相、液相色譜，SEM/AFM等儀器的聯(lián)用拓寬了拉曼光譜的應(yīng)用范圍，使其在研究分子微觀動(dòng)力學(xué)，蛋白質(zhì)構(gòu)相，超導(dǎo)體等方面發(fā)揮了重要作用。

隨著納米科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，各類制備不同納米顆粒以及二維有序納米圖案的技術(shù)和方法將日益成熟，人們可以比較方便地在理論的指導(dǎo)下，尋找在過(guò)渡金屬上產(chǎn)生強(qiáng)SERS效應(yīng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件。這些突破無(wú)疑將為拉曼光譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)新局面。總之，通過(guò)摸索合適的表面處理方法并采用新一代高靈敏度的拉曼譜儀，可將拉曼光譜研究發(fā)展成為一個(gè)適用性廣、研究能力強(qiáng)的表面（界面）譜學(xué)工具，同時(shí)推動(dòng)有關(guān)表面（界面）譜學(xué)理論的發(fā)展。[6]