修復(fù)創(chuàng)傷、組織再生甚至器官再生，一直是生物領(lǐng)域科學(xué)家努力攻克的難題。盡管人類具有一定的再生能力，例如皮膚、指甲、子宮內(nèi)膜和肝臟可以自然再生，但是這種能力與火蜥蜴、斑馬魚、非洲爪蟾等脊椎動物的再生能力相比就相形見絀了。為了促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，科研工作者在組織再生有關(guān)的生物學(xué)過程方面已經(jīng)進(jìn)行了許多努力。其中，斑馬魚和青鳉魚是被廣泛使用的脊椎動物模型，因為它們可以再生許多器官，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟，尤其是它們的尾鰭可以在截肢后具有無限的再生潛力。并且它們在幼魚階段具有透明的身體。為了研究組織再生過程中的生物學(xué)過程，生物學(xué)家最流行的研究方法是使用帶有熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因熒光魚。盡管熒光蛋白融合的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)提供了可能性。然而，該技術(shù)復(fù)雜、費時、昂貴、易于光漂白。而且熒光蛋白的大分子尺寸可能會影響目標(biāo)融合蛋白的功能。另一種流行的研究方法是熒光免疫組織化學(xué)染色。但是它需要固定和透化細(xì)胞，可能導(dǎo)致一些缺陷，例如，蛋白質(zhì)被提取或移位、蛋白質(zhì)表位受阻以及不能進(jìn)行實時成像，因此可能導(dǎo)致一些生物過程的信息是錯誤的或者缺失的。因此，迫切需要一種簡單的研究方法，能夠?qū)崟r觀察組織再生過程中的生物變化。

最近，香港科技大學(xué)唐本忠院士課題組與王文雄教授課題組合作，設(shè)計了一款比率計量型AIEgen探針，首次實現(xiàn)了在青鳉幼魚活體內(nèi)實時監(jiān)測其尾鰭再生過程中溶酶體pH的分布和pH值的變化。眾所周知，溶酶體pH是指示溶酶體水解酶活性和溶酶體功能狀況的重要參數(shù)，并且能提示細(xì)胞自噬的作用。因此，實時追蹤溶酶體的pH變化可以更全面地了解組織再生過程中的生物變化。

AIEgen的性質(zhì)

適合用于組織再生期間追蹤溶酶體pH的探針需要滿足以下要求：（1）好的光穩(wěn)定性；（2）長期跟蹤能力；（3）靶向溶酶體；（4）對pH敏感；（5）定量測量pH；（6）小魚體內(nèi)無創(chuàng)成像。然而，傳統(tǒng)的ACQ探針由于強烈的π-π堆積而在高濃度或聚集狀態(tài)下存在熒光猝滅的問題，并且容易被光漂白，不適用于長期跟蹤。與ACQ材料相比，AIE材料越多，其亮度就越亮。近幾十年來的研究已證明AIEgens具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，大的斯托克斯位移，出色的長期跟蹤能力和良好的生物相容性。

圖1示出了AIEgen （CSMPP）的晶體結(jié)構(gòu)和其聚集誘導(dǎo)發(fā)光的性質(zhì)。

pH響應(yīng)性和光穩(wěn)定性

CSMPP質(zhì)子化后分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的增強引起發(fā)射光譜極大的紅移，基于此而實現(xiàn)了比率型pH探針。此探針克服了基于強度變化的熒光探針受探針濃度變化和分布不均，溫度，環(huán)境極性和激發(fā)光波動的影響的問題。CSMPP還具有pH響應(yīng)的可逆性，而且能特異性測試pH而不受生命系統(tǒng)中某些常見化學(xué)物質(zhì)的干擾，以及具有良好的光穩(wěn)定性。另外，CSMPP的絕對pKa為4.75±0.02，剛好處于溶酶體的酸度窗口（pH 4.5-5.5），說明探針能夠測量溶酶體的pH。

圖2示出了CSMPP的pH響應(yīng)性，可逆性以及抗干擾性。

圖3示出了CSMPP，LTR和LTG分別染色的HeLa細(xì)胞在使用CLSM連續(xù)掃描后的光穩(wěn)定性。

青鳉幼魚成像以及尾鰭內(nèi)溶酶體的靶向

熒光共定位成像的結(jié)果表明，CSMPP對幼魚尾鰭的溶酶體具有與LysoTracker DeepRed（LTDR）一樣好的靶向性。

圖4示出了青鳉幼魚的全身成像和尾鰭的溶酶體共定位成像。

魚細(xì)胞內(nèi)pH的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

借助于H+/K+反向轉(zhuǎn)運尼日利亞菌素和H+/K+反向轉(zhuǎn)運莫能菌素來使細(xì)胞內(nèi)外的pH均質(zhì)化，獲得了不同pH下魚細(xì)胞的熒光比率圖像和pH校準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示在pH 3.0-6.5之間呈線性關(guān)系，這種線性關(guān)系將用于計算尾鰭的溶酶體pH值。

圖5示出了小魚細(xì)胞在不同pH下的比率型熒光圖片以及探針的pH定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

長期追蹤青鳉幼魚的尾鰭再生過程

CSMPP追蹤了尾鰭從截斷到再生逐漸恢復(fù)變成圓形的過程。并且顯示了在截斷后平均溶酶體pH先逐漸降低，在截斷后24-48 h達(dá)到最低pH。這是胚細(xì)胞形成的階段。由于此階段的再生主要依靠自噬來清除損傷造成的受損組織和細(xì)胞碎片。因此，為了幫助自噬降解，細(xì)胞的溶酶體酸化被上調(diào)。而且在此階段，截斷平面周圍的溶酶體（包括再生組織）比遠(yuǎn)離截斷平面的溶酶體的酸性更強。然后，隨著尾鰭的再生恢復(fù)，溶酶體的pH在120 h后也恢復(fù)至接近正常水平。

圖6示出了截斷前和截斷后不同時間的青鳉幼魚尾鰭的激光共聚焦圖片和溶酶體pH分布的比率型圖片。

圖7示出了青鳉幼魚尾鰭再生過程中其溶酶體的平均pH變化。

因此，該研究提供了一種簡單而定量的動態(tài)跟蹤方法來研究組織再生過程。并且該AIEgen探針還可用于追蹤各種溶酶體相關(guān)的生物過程，例如壓力反應(yīng)，炎癥反應(yīng)等。另外，該研究有助于啟發(fā)設(shè)計其它比率型熒光探針用于長期可視化跟蹤生物學(xué)的過程。以上相關(guān)成果發(fā)表在《Chemical Science》 (Chem. Sci., 2020,DOI: 10.1039/C9SC06226B.)上。論文的第一作者為香港科技大學(xué)博士后石秀娟，共同一作為香港科技大學(xué)博士生顏能，通訊作者為香港科技大學(xué)唐本忠院士，共同通訊作者為香港科技大學(xué)王文雄教授和郭子健研究助理教授。

參考文獻(xiàn)：X. Shi, N. YAN, G. Niu, S. H. P. Sung, Z.Liu, J. Liu, R. T. K. Kwok, J. W. Y. Lam, W. Wang, H. H-Y. Sung, I. D. Williamsand B. Z. Tang, Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/C9SC06226B.

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