摘要

在硅橡膠表面制備一種具有抗感染功能的涂層—殼聚糖載銅凝膠涂層。為了克服硅橡膠的生物惰性，在其表面制備涂層，先用逐步化學(xué)接枝法對(duì)其表面進(jìn)行活化預(yù)處理，然后化學(xué)接枝殼聚糖載銅凝膠涂層。對(duì)比浸泡前后涂層的形貌，研究了活化預(yù)處理對(duì)功能化涂層與硅橡膠基體之間結(jié)合性能的影響。結(jié)果表明，用化學(xué)接枝法可在硅橡膠表面生成豐富的活性官能團(tuán)從而提高了功能化涂層與硅橡膠的結(jié)合強(qiáng)度。載銅功能化涂層使硅橡膠導(dǎo)管具有良好的抗菌功能。

關(guān)鍵詞： 材料表面與界面 ; 功能涂層 ; 逐步化學(xué)接枝法 ; 硅橡膠導(dǎo)管 ; 結(jié)合性能

高分子材料在醫(yī)療器械方面的應(yīng)用十分廣泛，有良好的臨床效果。高分子材料發(fā)展迅速，種類繁多[1,2]。高分子材料可用于各類疾病的診斷和治療，包括制作植入體內(nèi)的器械[3]。常用的醫(yī)用高分子材料，有聚乙烯、聚丙烯、硅橡膠、聚乳酸、聚氨酯等。硅橡膠具有高度生物惰性和超疏水性等性質(zhì)，已成為主流植入器件用材料，如臨床使用的醫(yī)用導(dǎo)管和人工器官等[4,5]。但是，植入體內(nèi)的器件可能發(fā)生血栓和感染。對(duì)慢性病患者和血液透析病人極為重要的血管植入類導(dǎo)管，其相關(guān)性感染（Catheter-related blood stream infection, CRBSI）已成為引起相關(guān)血液感染的主要原因。導(dǎo)管并發(fā)癥不僅延長(zhǎng)病人的住院時(shí)間，增加治療費(fèi)用還會(huì)加重病人的痛苦，甚至危及其生命。因此，導(dǎo)管并發(fā)癥受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家和研究者的極大關(guān)注并引起了預(yù)防CRBSI的研究熱潮[6]。

為了消除醫(yī)用導(dǎo)管的臨床感染，在導(dǎo)管表面制備抗感染涂層成為研究的熱點(diǎn)。有研究表明，在導(dǎo)管表面制備抗菌涂層是一種解決感染的有效方法。目前已有多種功能性導(dǎo)管涂層。氟聚合物涂層包括：水凝膠涂層、仿生表面涂層等[7,8]；載藥涂層包括：二甲胺四環(huán)素和利福平、Ag NPs、慶大霉素、苯二酚改性殼聚糖/透明質(zhì)酸載藥涂層等[9~11]；納米材料涂層包括：目前研究較多的納米銀涂層[12~14]、二氧化鈦納米管載藥涂層等。以上這些抗菌涂層，都具有較好的抗菌效果。

醫(yī)用材料抗菌表面的構(gòu)建，主要是通過涂層、接枝和本體改性等途徑實(shí)現(xiàn)。導(dǎo)管表面抗菌涂層的制備簡(jiǎn)單快捷，且不改變其機(jī)械性能。殼聚糖/銀-銅復(fù)合抗菌劑涂層的抗菌性能優(yōu)良，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)到96%以上[13,15]。

在表面惰性的硅橡膠導(dǎo)管上制備抗感染功能化涂層，難度很大[16]。目前制備涂層的方法有：層層自組裝、浸涂、化學(xué)接枝法、溶膠凝膠、電泳沉積、滴涂、原位還原、聚合等[16]。高分子材料具有高度惰性和超疏水性能，在其表面制備涂層，為了使涂層與高分子基體更好的結(jié)合，需要對(duì)其表面進(jìn)行活化處理[17]。目前廣泛應(yīng)用的高分子表面活化方法，包括光輻射、等離子電離處理、臭氧引發(fā)等。為了使高分子表面產(chǎn)生極性基團(tuán)，可將親水性物質(zhì)化學(xué)反應(yīng)接枝到材料表面[18~21]。作為物質(zhì)第四態(tài)的等離子體，用于表面處理有簡(jiǎn)捷、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。但是等離子體處理技術(shù)具有時(shí)效性和損蝕性，使產(chǎn)業(yè)化受到限制。輻射法可使高分子材料表面活化，但是易加速其老化。化學(xué)接枝法使用硅烷化試劑等和層層自組裝過程使材料表面活化改性，適用性比較廣泛，可根據(jù)需要改性的基材特性調(diào)整化學(xué)接枝物質(zhì)組成，實(shí)現(xiàn)功能化涂層的鍵合。已有研究報(bào)道[22],可將殼聚糖鍵合到鈦基體表面：第一，在鈦基體表面沉積硅烷（IPTS）并形成Ti-O-Si共價(jià)鍵；第二，在戊二醛與IPTS末端的NH2化學(xué)鍵合成亞胺基，以提供反應(yīng)性醛基與殼聚糖分子形成共價(jià)鍵；第三，在鈦表面的醛基與殼聚糖上的氨基形成亞胺鍵。多巴胺可在多種材料表面形成聚多巴胺膜層。在硅橡膠表面制備聚多巴胺涂層可引入活性官能團(tuán)實(shí)現(xiàn)功能化涂層與硅橡膠器件的良好結(jié)合。本文在硅橡膠表面制備殼聚糖載銅凝膠涂層并研究其抗菌功能。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 涂層的制備

將厚度為2 mm的硅橡膠裁成面積為1 cm×1 cm的片狀樣品，然后用去離子水超聲清洗兩次（每次20 min），再用丙酮清洗5 min后用無水乙醇超聲清洗兩次（每次20 min），晾干后備用。

將待處理樣品浸泡在濃度為2 mg/mL的多巴胺的Tris-HCI溶液（濃度為1.0 mmol/L, pH=8.5）中，置于搖床振蕩48 h后用去離子水超聲清洗3 min,即得到表面覆蓋聚多巴胺（PDA）涂層的材料。然后將表面有PDA涂層的硅橡膠樣品浸沒在2.5%濃度的戊二醛溶液中24 h,棄去戊二醛溶液后用去離子水沖洗3次，自然晾干后待用。

配制濃度為1.5%的殼聚糖（粘度為50~800 mPa·s、脫乙酰度為90%）乙酸水溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CuSO4溶液，然后以10（殼聚糖）：1（CuSO4）體積比混合，再將其pH值調(diào)節(jié)至4.5。用提拉法在經(jīng)多巴胺和戊二醛處理后的硅橡膠材料上制備具有抗菌性能的涂層，自然晾干后在40℃烘箱中干燥6 h。

1.2 樣品的表征

使用TBU--95靜滴接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定樣品的接觸角，測(cè)試溶液為雙蒸水，液滴體積為0.6 μL。

用Buker D8 DISCOVER光電子能譜儀測(cè)試樣品的X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS），并使用XPSPEAK41軟件對(duì)不同元素的譜圖進(jìn)行分峰擬合處理。用掃描電子顯微鏡（Scan-ning electron microscope, SEM, HITACHI-3400 N, Japan）觀察截面形貌并測(cè)量涂層厚度，對(duì)比浸泡前后涂層形貌變化。

抗菌功能性評(píng)價(jià)：選擇實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)抗菌性能的標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（S. aureus, ATCC 25923）進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)ISO 10993-5:2009標(biāo)準(zhǔn)，用直接接觸法檢測(cè)涂層樣品的抗菌性能和抑制生物膜形成的能力。將表面有載銅涂層的硅橡膠樣品（以殼聚糖涂層處理樣品作為對(duì)照組）放入24孔板中，在每個(gè)樣品表面滴加50 μL濃度為2.3×108 CFU/mL的S. aureus菌液。將孔板放入溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育（5%CO2,90%濕度）培養(yǎng)24 h,并設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)以作比較。取出24孔板，吸棄細(xì)菌液并將PBS輕輕漂洗3次。在每孔加入2.5%的戊二醛溶液1 mL,在4℃冰箱中固定樣品表面細(xì)菌4 h。取出固定樣品后吸棄固定液，用PBS溶液清洗3次。依次在濃度為30%,50%,60%,70%,80%,90%,95%的乙醇溶液中梯度脫水10 min,最后在無水乙醇中脫水2次（每次5 min）。干燥24 h后用掃描電鏡觀察細(xì)菌的形貌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 預(yù)處理硅橡膠表面的XPS分析

圖1給出了硅橡膠表面經(jīng)聚多巴胺涂層處理的XPS全譜以及C,N和O元素的分峰處理結(jié)果。圖1a給出了XPS全譜，涂層處理后樣品的化學(xué)組成為C,N,O和Si。根據(jù)XPS精確譜（圖1b）：N元素在硅橡膠表面存在多種形式，擬合結(jié)果表明，N元素在鍵能為400.58,398.23和397.09 eV處出現(xiàn)三峰。圖1c給出了O的精確譜結(jié)果，多巴胺聚合后O元素主要以苯酚和苯醌形式存在，分峰結(jié)果證實(shí)O元素的存在形式為C=O和C-O,表明聚多巴胺成功接枝在硅橡膠表面。此外，在153.29和100.31 eV處可觀察到兩個(gè)強(qiáng)峰，分別為硅橡膠基體中Si2s和Si2p的峰。

圖1   逐步化學(xué)接枝處理后樣品的XPS譜圖

對(duì)經(jīng)戊二醛偶聯(lián)的硅橡膠樣品進(jìn)行XPS檢測(cè)，并對(duì)C,N與O的精確譜進(jìn)行擬合分峰處理，結(jié)果如圖1d所示，C元素結(jié)合能在286.2 eV處出現(xiàn)新形成的C=N亞胺基鍵。圖1e所示，在N元素結(jié)合能在397.14 eV處有C=N鍵能。如圖1f所示，與戊二醛偶聯(lián)前相比，O元素的存在形式由兩種變?yōu)槿N，以上結(jié)果均表明，經(jīng)戊二醛偶聯(lián)后成功地引入了醛基。

2.2 預(yù)處理硅橡膠的浸潤(rùn)性

浸潤(rùn)性是表征固體表面特性的一個(gè)重要參數(shù)，表示液體在固體表面鋪展的能力或傾向性，其受固體材料表面能、表面粗糙度以及表面微結(jié)構(gòu)的影響。圖2給出了硅橡膠經(jīng)聚多巴胺和戊二醛處理前后的水液滴形貌和相應(yīng)的接觸角。硅橡膠的接觸角為110°，經(jīng)多巴胺處理后的硅橡膠的接觸角為79°，說明聚多巴胺的粘附改變了硅橡膠的浸潤(rùn)性。再經(jīng)戊二醛處理后，硅橡膠的浸潤(rùn)性與聚多巴胺涂層相比沒有明顯的改變。經(jīng)聚多巴胺處理后硅橡膠的接觸角降低，表面張力下降，為后續(xù)的功能化涂層制備提供基本條件。

圖2   液滴形貌和接觸角

2.3 載銅功能涂層的XPS譜

圖3a給出了殼聚糖涂層的全譜，譜圖所示涂層中僅含有C,N,O三種元素。使用XPSPEAK41軟件對(duì)殼聚糖涂層中C、O和N三種元素的譜圖進(jìn)行分峰擬合，發(fā)現(xiàn)C1s、N1s與O1s的峰形均與預(yù)處理后樣品的峰形有較大差異。圖3b給出了C元素的分峰擬合結(jié)果。共有3個(gè)峰，表明C元素有3種存在形式，對(duì)應(yīng)的鍵能分別為282.05,283.75和285.50 eV,與之對(duì)應(yīng)的存在形式為C-N、C=O和殼聚糖分子六元環(huán)內(nèi)的C-O-C鍵；圖3c給出了N元素的分峰擬合結(jié)果。如圖所示，因其N元素主要以C-N狀態(tài)存在而受大環(huán)結(jié)構(gòu)和分子長(zhǎng)鏈的影響，其對(duì)應(yīng)的結(jié)合能約為397 eV,其中C-N鍵能為396.68 eV。由于實(shí)驗(yàn)中使用殼聚糖是脫乙酰度是90%,存在酰胺鍵（CO-NH），對(duì)應(yīng)的鍵能為397.45 eV。圖3d給出了殼聚糖為O元素的分峰擬合結(jié)果。如圖所示，制備了殼聚糖涂層后Ols峰面積大大增加，是殼聚糖分子中O元素含量高的緣故。

圖3   殼聚糖涂層和殼聚糖載銅涂層處理后硅橡膠樣品的XPS圖譜。

綜合上述結(jié)果，聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖載銅涂層的C元素的分峰擬合譜圖與聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖涂層中C元素的分峰擬合譜圖的形狀沒有明顯的不同，說明在殼聚糖與銅配位螯合過程中C原子的化學(xué)環(huán)境沒有變化[23,24]。如圖3g N元素的分峰擬合結(jié)果所示：配位后N元素有4種存在形式，其結(jié)合能分別為396,396.7,397和398 eV。與圖3c中聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖涂層的N元素分峰擬合結(jié)果相比，在398 eV處出現(xiàn)一新峰，與其它N1s結(jié)合能相比增大了1~2 eV,表明在接枝過程中有明顯的失電子傾向。圖3h給出了O元素的分峰擬合結(jié)果，可見配位后O元素有5種存在形式，對(duì)應(yīng)的結(jié)合能分別為528.4,529,530,530.5和531eV。與配位前殼聚糖中O元素的精確譜相比，在528.4eV出現(xiàn)一個(gè)新峰，與其他O1s結(jié)合能相比增加了0.5eV,表明O元素也有失電子傾向。CuSO4中Cu2+的結(jié)合能是單一的，位于935.6 eV。從圖3e可見，與殼聚糖螯合的Cu元素有3種存在形式，分別對(duì)應(yīng)的結(jié)合能是951、941和931 eV,其中結(jié)合能為931 eV的Cu2+在配位過程中有得電子傾向。結(jié)合殼聚糖分子鏈上N元素結(jié)合能的變化，可以認(rèn)為這部分Cu2+與殼聚糖的氨基是通過配位鍵結(jié)合的，據(jù)此可推斷Cu2+的結(jié)合能為941 eV是其與殼聚糖上的羥基配位所致。結(jié)合能為951 eV的Cu2+,為未參與螯合的銅離子。

2.4 涂層的表面形貌

為了研究預(yù)處理對(duì)涂層結(jié)合力的影響，對(duì)比了經(jīng)預(yù)處理前后樣品的表面形貌。如圖4a和b所示，直接在硅橡膠表面制備功能化涂層，涂層物質(zhì)在樣品表面局部聚集且有明顯的翹起。圖4d和e給出了經(jīng)多巴胺/戊二醛預(yù)處理后制備的功能化涂層形貌，可見涂層在樣品表面分布均勻，沒有翹起，表面有均勻的凸起，較平整。圖4e-給出了涂層截面厚度測(cè)量圖，可見涂層的平均厚度為5.06 μm。將涂層處理后的樣品在生理鹽水（0.9%NaCl）中浸泡3 d,觀察涂層表面形貌變化以評(píng)價(jià)結(jié)合性能。圖4c給出了未經(jīng)預(yù)處理樣品浸泡后形貌，可見表面涂層發(fā)生脫落；圖4f給出了經(jīng)多巴胺/戊二醛預(yù)處理后制備的功能化涂層樣品浸泡后形貌，可見涂層均勻，沒有明顯的脫落，在浸泡液中也未見脫落的涂層物質(zhì)。

圖4   用不同預(yù)處理工藝涂層處理后樣品的形貌

2.5 涂層的抗菌性能

圖5給出了金黃色葡糖球菌（S. aureus）分別在殼聚糖涂層和殼聚糖載銅涂層上的粘附狀態(tài)。如圖5a和b所示，S. aureus在殼聚糖涂層表面黏附數(shù)量較多，呈聚集狀態(tài)，局部已形成生物膜。如圖5c和d所示，S. aureus在殼聚糖載銅涂層表面只有少數(shù)細(xì)菌分布。細(xì)菌在載銅涂層表面沒有聚集，也就沒有形成生物膜。這些結(jié)果表明，殼聚糖載銅涂層具有明顯的抗菌功能，并且降低了細(xì)菌在涂層表面的附著力。這也表明，涂層與硅橡膠基體結(jié)合良好。

圖5   涂層處理后樣品表面金黃色葡糖球菌黏附形貌

3 討論

針對(duì)植入性醫(yī)療器件在長(zhǎng)期植入過程中的感染問題，本文將化學(xué)接枝法增強(qiáng)抗感染涂層與硅橡膠類器件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了器件的功能性。鑒于多巴胺在不同材料上的強(qiáng)力粘附特性，本文用多巴胺對(duì)具有疏水性的硅橡膠進(jìn)行預(yù)處理，引入活性基團(tuán)OH和NH2,隨后通過戊二醛偶聯(lián)引入醛基，最終將殼聚糖載銅涂層與硅橡膠基體以化學(xué)鍵的形式結(jié)合。圖1中的XPS結(jié)果表明，通過多巴胺聚合引入了N元素。根據(jù)圖6中多巴胺的聚合機(jī)理圖可以推斷，引入的部分N元素以NH2的形式存在的，為后續(xù)的化學(xué)接枝反應(yīng)提供了活性官能團(tuán)。隨后，經(jīng)戊二醛偶聯(lián)后，圖1e中N1s分峰結(jié)果顯示出現(xiàn)了N=C峰，表明聚多巴胺與戊二醛形成了新的化學(xué)鍵。以上預(yù)處理工藝不僅為后續(xù)的化學(xué)接枝提供了活性官能團(tuán)，還影響硅橡膠表面的浸潤(rùn)性。硅橡膠本體為疏水性材料，其水接觸角為110.3°，經(jīng)多巴胺預(yù)處理后接觸角下降到79°。由于液體在固體表面鋪展的能力或傾向性受固體材料表面能、表面粗糙度以及表面微結(jié)構(gòu)的影響[27],通過化學(xué)接枝法改變硅橡膠基體的表面能使硅橡膠基體的表面能降低。此外，聚多巴胺在硅橡膠表面的粘附使硅橡膠表面的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從另一個(gè)角度改善了水溶性溶液在硅橡膠表面的鋪展性。

圖6   多巴胺在水溶液中的自聚反應(yīng)[25]和聚多巴胺自聚反應(yīng)機(jī)理[26]

殼聚糖載銅功能化涂層溶液為水溶性溶液，因此涂層溶液在經(jīng)多巴胺和戊二醛兩步預(yù)處理后的硅橡膠表面的鋪展性明顯改善。根據(jù)浸潤(rùn)吸附理論，高聚物的黏結(jié)作用分為兩個(gè)階段。第一階段：高聚物大分子借助宏觀布朗運(yùn)動(dòng)從溶液中移動(dòng)到被粘物表面，通過微布朗運(yùn)動(dòng)大分子鏈節(jié)逐漸向被粘體表面的極性基團(tuán)靠近。第二階段：發(fā)生吸附作用。黏結(jié)要求達(dá)到后，為了進(jìn)一步改善性能，應(yīng)改進(jìn)被粘體對(duì)高聚物的浸潤(rùn)性[28]。根據(jù)以上理論，本文用聚多巴胺預(yù)處理方法大幅提高了功能化涂層溶液在硅橡膠基材上的浸潤(rùn)性，從而提高了涂層在基材上的吸附功。經(jīng)預(yù)處理后的硅橡膠，再通過化學(xué)接枝法與殼聚糖載銅功能化涂層（殼聚糖作為對(duì)照）以化學(xué)鍵的形式結(jié)合。對(duì)比功能涂層制備前后的XPS結(jié)果，對(duì)N1s進(jìn)行分峰擬合處理結(jié)果表明，有酰胺鍵和亞胺鍵形成。這表明，殼聚糖涂層以化學(xué)鍵合的形式成功接枝到硅橡膠表面。采用浸泡法對(duì)涂層與硅橡膠基體的結(jié)合性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比浸泡前后硅橡膠樣品的表面形貌，表明經(jīng)多巴胺和戊二醛兩步預(yù)處理可有效提高功能化涂層與硅橡膠基體的結(jié)合性能。由于涂層厚度對(duì)涂層與基體間的結(jié)合力影響較大，隨著涂層厚度的增加涂層與基體間的結(jié)合性能將減弱。因此，本文用提拉法進(jìn)行一次提拉制備殼聚糖載銅功能化涂層樣品和對(duì)照組的樣品，涂層平均厚度為5.06 μm。

細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌在經(jīng)一次提拉制備的殼聚糖載銅功能化涂層樣品表面的粘附明顯少于對(duì)照組的殼聚糖涂層處理的樣品，表明載銅涂層具有殺菌性能。本文選擇殼聚糖涂層樣品作為對(duì)照組，旨在突顯載銅涂層的優(yōu)異抗菌功能。有研究表明：材料表面的親/疏水性影響細(xì)菌、真菌和蛋白的粘附[29]。Duncan Hewitt還指出[30],疏水作用是影響大多數(shù)致病原粘附的主要驅(qū)動(dòng)力。還有學(xué)者報(bào)道，材料表面親水性的提高可有效減少材料與蛋白質(zhì)的接觸和非定向結(jié)合，從而減少污染物在材料表面的吸附沉積[31]。本文使用的功能涂層為水溶性溶膠物質(zhì)，得到的功能涂層為親水涂層，從而使硅橡膠的親水能力增強(qiáng)，在一定程度上降低了細(xì)菌在涂層表面的粘附傾向。制備功能化涂層，一方面提高了硅橡膠表面的親水性，降低細(xì)菌在材料表面的粘附；另一方面，涂層中的銅具有高效的殺菌作用，這種雙重作用使硅橡膠表面細(xì)菌的粘附能力降低。根據(jù)本文的研究結(jié)果和理論推斷，殼聚糖載銅功能化涂層能有效降低硅橡膠導(dǎo)管發(fā)生感染的幾率。當(dāng)然，殼聚糖載銅涂層的抗菌性與涂層中所載銅離子的含量呈正相關(guān)。

4 結(jié)論

（1） 在硅橡膠表面制備聚多巴胺仿生涂層，可改變其表面微結(jié)構(gòu)并提高表面粗糙度，聚多巴胺中大量的氨基官能團(tuán)可提高表面的浸潤(rùn)性。

（2） 用逐步化學(xué)接枝方法在材料表面構(gòu)建活性位點(diǎn)，與涂層材料進(jìn)行化學(xué)鍵合，可提高涂層與硅橡膠基體間的結(jié)合強(qiáng)度，從而使硅橡膠具有良好的抗感染功能。

（3） 改性后的醫(yī)用硅橡膠導(dǎo)管具有良好的抗菌功能，導(dǎo)管表面的涂層能經(jīng)受長(zhǎng)期浸泡，可應(yīng)用于臨床。